امراض فيروسی
امراض فيروسی
قسم الكشف الجزيئی
تستخدم إحدى طرق تكرار الحمض النووي DNA طريقة PCR. بسبب الاستخدامات و الفوائد العديدة، توسعت هذه الطريقة بسرعة في المختبرات الجزيئية وهذه الطريقة تستخدم الآن بشكل شائع في هذه المختبرات.
تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
في عام 1983 ، عملت موليس على تفاعل سلسلة البلمرة لتضخيم تسلسل الحمض النووي DNA معين. من حيث المبادئ العملية ، يشتمل PCR على تشابه كبير لتكاثر الحمض النووي DNA ، وهو مأخوذ منه بالفعل. تتضمن تقنية PCR دورات متكررة يتم فيها تسخين الحمض النووي وتبريده بمساعدة من الاشعال ، وهو إنزيم بوليميريز الحمض النووي DNA المقاوم للحرارة في ظل ظروف التخزين الموقت المناسبة
و یون + Mg²، وبحضور أربعة منشئي dNTPs (DNA) ، يقومون بإجراء نسخ متماثل على قالب DNA.
عملية نسخ الحمض النووي DNA هي الأسية في هذه الطريقة ، وبالتالي يمكن الحصول على كمية كبيرة من الحمض النووي DNA. الاشعال تكمل أجزاء من سلسلتين من الحمض النووي DNA وتحدد المنطقة المراد ضربها.
اليوم، طريقة PCR لها دور هام جدا في تحديد وعزل الجينات والاستنساخ والبيولوجيا الجزيئية،علم الأحياء الدقيقة التشخيصي، تشخيص السرطان والأمراض الوراثية، تحديد الهوية، علم الإجرام، التسلسل، علم الآثار، دراسة تطورية للكائنات الحية.
خطوات PCR
خطوة التهيئة: (Initialization step)هذه الخطوة ضرورية فقط للحمض النووي DNA بوليميريز الذي يتطلب تنشيط الحرارة في طريقة hot-start PCR. في هذه المرحلة ، تكون درجة حرارة التفاعل في محلول التفاعل من 94 إلى 96 درجة مئوية لفترة معينة.
خطوه تغییر المجری(Denaturation step): فی هذه المرحله به سبب انهیار روابط الهیدروجین بین النیوکلیوتیدات، یتم فصل نوعین من انماط الحمض النووی DNA و یتم الحصول علی خیوط واحده من الحمض النووی DNA هذه المرحله هی الجزئ الاول من الدورات الحراریه و تتضمن تسخین محلول التفاعل لفتره محدده من 94 الی 96 درجه.
الاتصال (Annealing step):عند هذه النقطة، تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50 إلى 65 درجة ، و یودی التمهيدي لنفس قطعتي الدنا التي ترغب في نسخها لتكرار تسلسل مصمم لتكوين تسلسلات تكميلية في مجال الحمض النووي DNAالمفتوح المرفق. توفرهاتان القطعتان المفتوحتان ΄۳نشاط البلمرة DNA
خطوة الامتداد (Extension/elongation step): يتم استخدام درجة حرارة المذيب في هذه الخطوة ، اعتمادا على نوع DNA البلمرة. تتراوح درجة الحرارة المثلى لإنزيم Taq polymerase ما بين 75 و 80 درجة والتي يتم اختيارها عادة عند درجة حرارة 72 درجة. في هذه المرحلة، فإن إنزيم الحمض النووي DNA، باستخدام أربعة منشئي الحمض النووي DNAللمصدر المفتوح في المحلول ، يشكل تسلسل الحمض النووي DNAالجديد بترتيب من 5 إلى 3 ومقابل خيوط القالب. يجب أن يتناسب طول هذه الخطوة ایضا مع نوع بوليميريز الحمض النوويDNA وطول حبلا الحمض النوويDNA . في هذه المرحلة، في ظل وجود الركيزة الكافية وتوفير الظروف المثلى، يتضاعف محتوى الحمض النووي DNA في محلول PCR. لذلک، في كل دورة من دورات PCR ، يزيد تركيز الحمض النووي DNA بشكل كبير.
الاستطالة النهائية(Final elongation): يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد دورة PCR نهائية عند درجة حرارة تتراوح من 70 إلى 74 درجة ، لضمان أن يتم تكرار جميع فروع الحمض النووي DNA.
تعليق نهائي(Final hold): في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الحل النهائي من 4 إلى 15 درجة لفترة قصيرة.
دورة درجة الحرارة وتضخيم الجينات المستهدفة في اختبار PCR
- رحلان كهربائي في جل اکارز: اخیرا، يمكن أن تحلل منتجات PCR على هلام اکارزمع علامة وزن جزئی) DNA ladder يحتوي على شظايا DNA محددة) ، ويتم فحص نتائج PCR.
خطوات لأداء الكهربائي
رد فعل RT-PCR
RNA يشكل الحمض النووی mRNA و rRNA بأعداد كبيرة في الخلايا حقيقية النواة للحيوانات والنباتات والفطريات وكذلک في البكتيريا. في تقنية RT-PCR ، لأنه يتم استخدام RNA كقالب نسخ متماثل ، يجب تحويل مرحلة RNA إلى cDNA. يتم تحويل الحمض النووي RNA المستخرج إلى [كدنا] باستخدام إنزيم يسمى cDNA العكسي. ثم يتم cDNA [كدنا] التي تنتجها تقنية PCR.
