الامراض الطفيليه

قسم الكشف الجزيئي

تستخدم إحدى طرق تكرار DNA الحمض النووي طريقة PCR. بسبب الاستخدامات والمزايا العديدة، توسعت هذه الطريقة بسرعة في المختبرات الجزيئية ، وهذه الطريقة تستخدم الآن بشكل شائع في هذه المختبرات.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

في عام 1983، عملت کاری موليس على تفاعل سلسلة البلمرة لتضخيم تسلسل الحمض النووي DNA معين. من حيث المبادئ العملية ، يشتمل PCR على تشابه كبير لتكاثر الحمض النووي DNA ، وهو مأخوذ منه بالفعل. تتكون تقنية PCR من دورات متكررة يتم فيها تسخين الحمض النووي DNA وتبريده بمساعدة من الاشعال ، يكون إنزيم بوليميريز الحمض النووي المقاوم للحرارة مناسبا لظروف التخزين المؤقت وأيون gMg² وفي وجود أربعة منشآت dNTPs (DNA) تعمل على الحمض النووي DNAالقالب یودی النسخ المتماثل.

عملية نسخ الحمض النووي DNA هي الأسية في هذه الطريقة، وبالتالي يمكن الحصول على كمية كبيرة من الحمض النووي DNA الاشعال تكمل أجزاء من سلسلتين من الحمض النووي DNA وتحدد المنطقة المراد ضربها.

اليوم ، طريقة PCR لها دور هام جدا في تحديد وعزل الجينات والاستنساخ والبيولوجيا الجزيئية،علم الأحياء الدقيقة التشخيصي ، تشخيص السرطان والأمراض الوراثية ، تحديد الهوية، علم الإجرام، التسلسل، علم الآثار، دراسة تطورية للكائنات الحية.

خطوات PCR

خطوة التهيئة: (Initialization step)هذه الخطوة ضرورية فقط للحمض النووي DNA بوليميريز الذي يتطلب تنشيط الحرارة في طريقه hot-start PCR في هذه المرحلة ، تكون درجة حرارة التفاعل في محلول التفاعل من 94 إلى 96 درجة لفترة معينة.
خطوة تغيير المجرى: (Denaturation step) في هذه المرحلة ، بسبب انهيار روابط الهيدروجين بين النيوكليوتيدات ، يتم فصل نوعين من أنماط الحمض النووي DNA ويتم الحصول على خيوط واحدة من الحمض النووي هذه المرحلة هي الجزء الأول من الدورات الحرارية وتتضمن تسخين محلول التفاعل لفترة محددة من 94 إلى 96 درجة.
خطوة التلدين:(Annealing step) في هذه المرحلة، يتم تقليل درجة حرارة التفاعل من 50 إلى 65 درجة مئوية ، ويتم تصميم الاشعال ، والتي تشبه الجانبين من شريحة الحمض النووي DNAالمراد إعادة إنتاجها، لتكمل تسلسل الحمض النووي التكميلي في الحمض النوويDNA المفتوحين فروع. أن تكون هاتان القطعتان ΄۳ المفتوحتان توفران نشاط بوليميريز الحمض النووي. DNA
خطوة الامتداد / الاستطالة: يتم استخدام درجة حرارة المذيب في هذه الخطوة ، اعتمادًا على نوع DNA البلمرة. تتراوح درجة الحرارة المثلى لإنزيم بوليميريز Taq ما بين 75 و 80 درجة ، والتي يتم اختيارها عادة عند درجة حرارة 72 درجة.
في هذه المرحلة، (Extension/elongation step)فإن إنزيم بوليميريز الحمض النووي DNA، باستخدام أربعة منشئي الحمض النووي Taq polymerase للمصدر المفتوح في المحلول من 75 الی 80 ، يشكل تسلسل الحمض النووي 72 الجديد بترتيب من 5 إلى 3 ومقابل خيوط القالب. يجب أن يتناسب طول هذه الخطوة أيضا مع نوع بوليميريز الحمض النووي DNA وطول حبلا الحمض النووي في هذه المرحلة ، في ظل وجود الركيزة الكافية وتوفير الظروف المثلى ، يتضاعف محتوى الحمض النوويDNA في محلول PCR. لذلک، في كل دورة من دورات PCR ، يزيد تركيز الحمض النووي بشكل كبير.
الاستطالة النهائية: (Final elongation) يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد دورة PCR نهائية عند درجة حرارة تتراوح من 70 إلى 74 درجة ، لضمان أن يتم تكرار جميع فروع الحمض النووي
تعليق نهائي: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الحل النهائي من 4 إلى 15 درجة لفترة قصيرة.
دورة درجة الحرارة وتضخيم الجينات المستهدفة في اختبار PCR
رحلان كهربائي (Final hold) :أخيرا ، يمكن أن يتم إلكترودا على منتجات PCR على هلام agarose مع علامة وزن جزيئي (سلم DNA يحتوي على شظايا DNA محددة

الرحلان الكهربائي (Final hold) أخيرا ، يمكن أن تحلل منتجات PCR على هلام الاغاروز مع علامة الوزن الجزيئي (سلم الحمض النووي DNA ladder يحتوي على شظايا الحمض النووي DNA المحددة) ، ويتم فحص نتائج PCR.

خطوات لأداء الكهربائي

رد فعل RT-PCR

RNAيشكل الحمض النووي الريبي (mRNA) و (rRNA) بأعداد كبيرة في الخلايا حقيقية النواة للحيوانات والنباتات والفطريات وكذلک في البكتيريا. في تقنية RT-PCR ، لأنه يتم استخدام RNA كقالب نسخ متماثل ، يجب تحويل مرحلة RNA إلى cDNA. يتم تحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى [كدنا] باستخدام إنزيم يسمى ناقلات النسخ العكسي. ثم يتم نسخ [cDNA] التي تنتجها تقنية PCR.

Real time PCR

طريقة PCR هي تقنية ذات حساسية عالية وخصوصية للكشف عن الأحماض النووية ، والتي تم تأسيسها واستخدامها بشكل جيد ، ولكن ليس من السهل تحديد الأحماض النووية المحددة الموجودة في العينة والتغیيرات التي قد تحدث أثناء التحضير والتخزين، أو إجراء رد فعل ، من الصعب تحديد كمية الأحماض النووية المحددة بدقة. السرعة التي يتم بها إجراء التجربة ، والقضاء على المرحلة اللاحقة لفترات طويلة مثل الرحلان الكهربي للهلام Southern blotting أو النشاف الجنوبي، ومراقبة لحظة رد الفعل وحتى لحظة رد الفعل وإنهائها في أي وقت، والحساسية العالية والخصوصية، وإجراء تفاعل كمي ، والحصول على الكمية الدقيقة من الجينوم في الطريقة الحقيقية لقد أحدثت Real time PCR تحولا كبيرا في مجالات العلوم المختلفة. تم تقدیم الفکره الاولی لهذا النهج من قبل هیغاشی و زملاوه و هو مفهوم ملاحظه الفوریه لحظیه استنادا الی مقدار التالق المنبعث من التفاعل و الملاحظه و التسجیل فی المعرف . فی هذه الطریقه، یتم استخدام مبسار ذو تسمیه خصص التوصیلیه للجینوم المستهدف. تستخدم هذه الطرق حالیا فی مجموعات التشخیص بطریقتین. فی الطریقه الاولی، یضاف المسبار إلى المنتج بعد النسخ المتماثل ويضاف إلى المنتج أثناء عملية التهجين ، وتشكل هذه الطريقة ، التي لها حساسية عالية ، أساس المصفوفة الدقيقة Micro array وتستخدم لتحديد النمط الوراثي. في الطريقة الثانية ، يكون المسبار موجودا في التفاعل ويتحلل أثناء الانتشار ويصدر ضوءا يمكن قياسه في أي دورة معينة ، وهذه هي طريقة Real time PCR الحقيقية.

طرق العلامات الشائعة في Real time PCR

طرق الوسم المستخدمة في Real time PCR يمكن تقسيمها إلى فئتين.

استخدام الألوان المرتبطة DNA

Syber green I هو اللون الأكثر استخداما في أنظمة الكشف غير المحددة في دراسات البيولوجيا (nonspecific detection system) ، ولكن تم استخدام ألوان أخرى مثل Amplifour مؤخرا.

سایبرجرین هو لون فلوري قابل للذوبان ولا يرتبط بخاصية مضان صغيرة ، ولكن مع ارتباط الحمض النووي الجزيئي الصغير (DNA Minor Groove) DNA في الصلب وتسلسل Annealing الحمض النووي DNA ، ينبعث منها المزيد من ضوء الفلورسنت في وقت واحد مع زيادة الحمض النووي DNA المزدوج الحمض النووي. أساس طريقة Real-Time القياس في الوقت الحقيقي هو أن كمية ضوء الفلورسنت المنبعثة في كل دورة يقرأها الجهاز

الحصول على كمية من ضوء مضان المنبعث يمثل مستوى النموذج الأولي ويتناسب مباشرة مع كمية منتجات PCR. عندما يتم مضاعفة الحمض النووي DNA في دورات متتالية ، يقترن اللون بالمنتجات التي يتم نشرها ويزداد شدة الإسفار عند 520 نانومتر. تزداد إشارة الإسفار في طور التمديد extension، بمعنى آخر، أقصى مضان في نهاية مرحلة الامتداد extension وعلى الأقل في مرحلة التغییر denaturation. مضان المنبعث من الجهاز هو التعرف وقابلة للقياس.

أساس طريقة سایبرجرین

هذه الطريقة سهلة للغاية وفعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب تصميم المسبار والمشاكل المرتبطة به. بطبيعة الحال ، نظرا لأن سایبرجرین لا يقتصر على تسلسل معين ولا يمكن تمييزه بين الحمض النووي DNA الناتج والمنتج غير المحدود والاشعال التمهيدي ، يجب رسم منحنى Melting Curve Analysis وفقا لمخطط الانصهار لكل رسم بياني . وبالتالي ، بعد نهاية PCR ، يزيد الجهاز درجة حرارة منتجات PCR إلى 94 درجة. عند درجة الحرارة هذه، تكون جميع الحمض النووي DNA تقطعت بهم السبل، ثم تنخفض درجة الحرارة بانتظام ، مع تحريف الحمض النووي DNA واستبدال وربط السيبرني والزيادة المفاجئة لكمية الإنبعاث المنبعث هو منحنى انصهار يمكن تمييزه بواسطة غير محددة، والتمهيدي عن طريق تحليل منحنى الانصهار. يتم إذابة منتجات PCR ذات متواليات أو أطوال متفاوتة في درجات حرارة مختلفة وتوفر ذروة محددة. في استجابة لذلک، فقط منتج PCR خاص، ساعي واحد فقط مرئي.

بمعنى آخر، في هذه الطريقة، يزيد الجهاز ببطء من درجة حرارة العينات ويزيد بشكل مستمر من شدة كل مضان من درجة حرارة أقل من نقطة الانصهار إلى درجة حرارة أعلى من نقطة انصهار المنتج (التي يحددها المستخدم في نطاق). يتم إذابة المنتجات وفقا لطول وكمية GC في الشريط عند درجات حرارة مختلفة. يتميز ذوبان كل منتج بانخفاض مفاجئ في كثافة مضان العينة التي يقيسها الجهاز. من خلال فحص الفرق في منحنيات الانصهار، يتم تحديد نقطة الانصهار لكل منتج مضروب. بهذه الطريقة ، يمكن الحصول على الكمية الفعلية للمنتج في نهاية التفاعل.

تحليل الرسم البياني درجة حرارة الانصهار

استخدام مسبار

مع هذه التحقيقات ، زادت الحساسية والنوعية. في هذه التحقيقات ، لون مضان يسمى Reporter في 5 ولون مضان آخر في 3 يسمى Quencher. عندما يكون Reporter و Quencher على مقربة (في الوضع المعتاد للمسبار) إذا كان الضوء ينبعث من Quencher Absorbed ولم يتم تسجيله ، ولكن بمجرد فصل هذين اللونين (بسبب انتشار وانهيار المسبار) ، لا يتم امتصاص الضوء المنبعث من Reporter بواسطة Quencher ويمكن قياسه من قبل الجهاز كما مضان.

الألوان المستخدمة في Real time PCR

مسبار Taq Man: إنزيم Taq Polymerase يحط من نشاط النواة أثناء انتشار΄ ۵ نمط المسبار ، ثم يتم عزل المراسل من Reporter من Quencher التألق.

مسبار Beacon:

يحتوي هذا المسبار على هيكل على شكل حلقة بألوان في نهايتي 3 و 5 ، لكنه لا ينقسم إلى رجل Taq Man ويستخدم في الدورات اللاحقة.

Hybridization Probes

في هذا النظام ، المسمى Fret (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ، تم تصميم المسبار في شكلين مختلفين ، وألوان مضان التألق هي واحدة في نهاية 3 والآخر في نهاية 5 ، ثم عندما يتم تطبيق هذين اللونين بعد إرفاق التحقيق. بالإضافة إلى ذلک ، يتم إصدار مضان وقياس بواسطة الجهاز.

طرق في Real Time PCR

يتم قياس منتج التسلسل المستهدف بطريقتين:

الكمي المطلق (Absolute Quantification)

في هذه الطريقة ، يتم حساب عدد التتابعات المستهدفة في العينة عادة باستخدام إشارة Real Time PCR نسبة إلى المنحنى القياسي. يمكن رسم المنحنى القياسي وفقًا للمعايير المحددة. يتم استخدام هذه الطريقة دون حساب المنحنى القياسي وحساب عدد النسخ في التشخيص النوعي في مجموعات التشخيص.

الكمي النسبي (Relative Quantification)

في المقياس النسبي ، يتم التعبير عن التعبير الجيني المرغوب به من حيث الجينات الهيكلية الخلوية المعروفة باسم House Keeping Gene. واحدة من الجينات الهيكلية للخلية هي Act-Actin و GAPDH. هذه الطريقة أكثر قابلية للتطبيق في تقييم التعبير الجيني Absolute Quantification، إلى جانب القياس الكمي المطلق.

در اندازه گیري نسبی میزان بیان ژن مورد نظر را نسبت به ژنهاي ساختاري سلول تحت عنوان House Keeping Gene بیان می کنند. از جمله ژنهاي ساختاري سلول می توان به β-Actin و

مع العديد من التطورات التي تحققت اليوم ، يتم استخدام هذه التقنية كوسيلة دقيقة وحساسة لتحديد الحمض النووي والحمض النووي DNA الريبي. في هذه التقنية ، يتم قياس منتجات PCR خلال المرحلة الأسية لعملية PCR.

يمكن اكتشاف إشارة التألق خلال أو بعد كل دورة من دورات PCR ويتم الحصول على نتائجها على مدى فترة زمنية قصيرة. أيضا ، نظرا لعدم فتح باب أنابيب التفاعل ، يكون خطر تلوث منتجات PCR منخفضا للغاية. يحدد القياس(Exponential phase) الكلي للمنتجات في PCR القدرة على التفاعل ، مما يجعل اختيار تقييمات أكثر حساسية ممكنا. يوجد حاليا العديد من الأدوات المتاحة Real Time PCR التي تقيس مجموع المنتجات باستخدام مضان في كل دورة. مضان قياس يتناسب مع دورة تمثل التضخيم.

في الواقع ، فإن أفضل مرحلة استنساخ يتم فيها الحصول على بيانات مفيدة ومتكررة هي مرحلة ثابتة. في هذه المرحلة من دورة الانتشار، هناک علاقة وثيقة بين كمية الحمض النووي الأساسي والمنتج المنتشر. Real Time PCR هو الحل الأمثل لتحديد كمية المنتج المنتج في هذه المرحلة (amplification). تشمل أجهزة Real Time PCR في الوقت الحقيقي اليوم أجهزة التنظيف الحراري ومقاييس الفلور التي تقيس كمية التألق في كل دورة. يجمع الكمبيوتر المتصل بالجهاز البيانات ويعرضها في شكل رسوم بيانية. يتم تسجيل بيانات صورة الإسفار مرة واحدة على الأقل لكل دورة استنساخ. يمكن للمستخدم التحكم في معدل التكاثر لكل عينة في كل دورة ومراقبة مقدار التكرار مقارنة بالمعايير والتحكم الإيجابي والتحكم السلبي.

الرسم البياني الازدواجية لوغاريتمي في Real Time PCR

بالإضافة إلى ذل; ، يمكن للمستخدم التحكم في جميع الاستجابات أثناء عملية التكاثر ويمكنه ، استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها خلال الدورات ، تحسين إرشادات الماكينة ، مما يزيد من الحساسية والخصوصية والكفاءة. بعد جمع البيانات الأولية ، تبدأ مرحلة التحليل. سيقوم البرنامج بتطبيع جهاز البيانات بناء على اختلافها مع مضان المجال. عند الانتهاء من التطبيع ، يمكن تحديد خط العتبة. الخط هو العتبة الخطية التي سيتم تحليل البيانات عليها. عدد الدورات حتى يصل منحنى العينة إلى خط العتبة ، CT. يتم اختيار خط العتبة بحيث يتم تعظيم مقدار تكرار الحمض النووي DNA في المرحلة الثابتة لإعطاء نتائج أكثر دقة وقابلة للتكرار.

الرسم البياني الازدواجية الخطية في Real Time PCR

تسمى الدورة التي ينحني Real time PCR خط Thresholdبخط العتبة CT ، ومن هذه الدورة ، يدخل التكاثر في المرحلة اللوغاريتمية Exponential ويصل إلى المراحل الأسية ويصل في النهاية إلى مرحلة تشبع Plateau الهضبة.

في حالة العينات القياسية ذات التركيزات المعروفة ، يتم رسم المنحنى القياسي عن طريق تحليل الانحدار الخطي ويتم حساب تركيز العينات غير المعروفة.

اجهزه ترموسایکر المستخدمه فی القسم التشخیص الجزئیی

الاجهزه ذات الصله Real Time PCR (Quantitative PCR)

اجهزه ذات الصله PCR نوعی یا Conventional (Qualitative PCR)

مختبر باستور للتشخيص الطبي

حائز على شهادة نظام إدارة الجودة ISO 9001: 2008

عنوان: اهواز، کیانبارس، شارع اسفند الشرقی، وحده 19، هاتف ۳۲۲۲۷۱۰۵-۰۶۱ (عشر خطوط)

موقع www.pasteurlab.ir

ساعات العمل : ۷ صباحا الی ۲۰ مساء

شبکه تیلیجرام pasteurlab@

صفحه اینستاجرام pasteurlaboratory