قياس التدفق الخلوي

قياس التدفق الخلوي هو طريقة دقيقة وعالية الأداء تستخدم لتحديد الخلايا وتقييم خصائصها. تعتمد هذه التقنية على انتشار الضوء بواسطة الخلايا المختبرة وانبعاثها الفلوري. يتم الحصول على انبعاثات الإسفار مباشرة باستخدام الفلورية تعلق على المكونات الخلوية أو مزيج من مضان وأضداد وحيدة النسيلة. هذه الأجسام المضادة المتقاربة الفلورة يمكن أن تكتشف وتعلق جزيئات سطحية أو توليفات داخلية للخلايا وتسمح بالكشف عن أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. يستخدم مقياس التدفق الخلوي على نطاق واسع في الأقسام البحثية والمختبرات التشخيصية ويستخدم لتشخيص وتشخيص تشخيص الأمراض وكذلك لتقييم علاج الأورام الخبيثة.

تدفق المبادئ العامة قياس التدفق الخلوي

في هذه الطريقة ، يتم وضع الخلايا الملطخة (باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مرتبط بالفلورة أو الفلوریه) في تيار مائع وتمر عبر بعضها البعض في اتجاه شعاع ضوئي (ليزر).

يتوزع ضوء الليزر على الكاشف بعد الاصطدام بالخلية (forward scatter)، إما في الانتثار الأمامي والعامودي على محور الانتثار الجانبي ، ويرتبط إما بالفلوركروم المتصل بسطح الجسيم (side scatter)، وفي هذه الحالة تتلامس الفلوركروماتس مع السطح أو داخل الخلية ، يتم تحفيزها بواسطة أشعة الضوء الليزرية وتمتص طاقة الضوء المنبعثة من الضوء ثم تطلق إشعاع الفلورة عند طول موجة آخر. يمكن لنشر الضوء عند زوايا مختلفة أن يميز الخلايا عن الاختلافات في الحجم والتعقيد ، في حين أن الانبعاث الفلوري من الأجسام المضادة الفلورية المسمى يمكن أن يميز الخلايا على أساس الاختلافات في المستضدات السطحية والسيتوبلاسمی. ثم يتم تمييز الخلايا بناء على خصائص مثل الحجم ، التحبيب وتشبع اللون.

يقيس جهاز قياس التدفق الخلوي نوع ومقدار الفلورة ، بالإضافة إلى درجة أو مسار انتشار أشعة الضوء. بعد قياس وتحليل المعلمات التي تم الحصول عليها من الخلية أو الجسيم الذي يمر عبر أشعة الضوء ، يتم الحصول على معلومات عن حجم أو شكل أو بنية الخلية أو الجسيمات المدروسة. أيضا ، إذا تم تلطيخ خلية أو جزيء مع واحد أو أكثر من الفلوریه مضان ، فإن أشعة الضوء تستحضر هذه الألوان، وبالتالي ، بالإضافة إلى النتائج من حجم الخلية وهيكل ، معلومات عن النشاط الأيضي ، ومحتوى الحمض النووي ، وجود خلايا سطح أو جوهرية محددة. تستحضر الأشعة الضوئية هذه الألوان ، وبالإضافة إلى نتائج حجم الخلية وهيكلها ، سيتم أيضًا الحصول على معلومات حول النشاط الأيضي ، ومحتوى DNA ، ووجود خصائص محددة أو جوهرية للخلية. يتم تجميع المكونات البصرية والإلكترونية الدقيقة لجهاز قياس التدفق الخلوي ، الإشارات الفلورية وحزم الضوء المنتشرة بواسطة العدسات المناسبة ، وبعد ذلك ، باستخدام الفلاتر المناسبة ، يتم توجيه كل من الإشارات الضوئية نحو المكشاف المناسب. تقوم أجهزة الكشف بتحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية (متناسبة مع الضوء المتجمع) ، ومن ثم يتم معالجة الإشارات وتحليلها بواسطة البرنامج. وبالطبع ، فإن بعض أجهزة قياس التدفق الخلوي قادرة أيضًا على اكتشاف وفصل الخلايا والجسيمات. بعض هذه فواصل الخلايا يمكنهم الكشف عن 70000 خلية في الثانية وفصلها في أنابيب منفصلة.

الفلوریه المستخدمة في التدفق الخلوي

عدد الفلوریه المستخدمة في التدفق الخلوي قد تزايد على مر السنين. فهم أنواع مختلفة من الفلوریه ومعرفة مزاياها وعيوبها هو السبيل الوحيد لتحقيق الاستخدام الأمثل لأهداف البحث العلمي. اليوم ، يتم استخدام مجموعة متنوعة من الفلوریه لتلوين الخلايا ومكوناتها الداخلية. أكثر أنواع الفلوركرومات شيوعا المستخدمة في قياس التدفق الخلوي هي Fluorescein Isothiocyanate (FITC) و Phycoerythrin (PE). هذه أطياف مضان الإسفار لديها مجموعة من 488nm. لذلك ، يمكن أن يحفز طول الموجة المحفزة بالليزر هذين اللونين.وقد تمكنت أجهزة قياس التدفق الخلوي من تحليل لون مضان واحد أو اثنين فقط. ولكن اليوم هناك أجهزة يمكنها اكتشاف ومعالجة أحد عشر مضان الألوان في نفس الوقت. تم فتح التحسينات المتزامنة في الأجهزة ، وإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، والأصباغ الفلورية ، والحواسيب والبرمجيات ، وصمام جديد لتقنية التدفق الخلوي ، في المختبرات السريرية.

المكونات الرئيسية لنظام التدفق الخلوي

بشكل عام ، يمكن تقسيم المكونات الرئيسية لجهاز قياس التدفق الخلوي إلى ثلاثة أجزاء:

نظام Fluidics ، في طريقة تدفق الخلوی، لفحص الخلايا ، يجب أن تكون في طابور، بشكل فردي وفي السائل المناسب، علقت من الضوء (الليزر). بشكل عام ، يدخل نظام Fluidics تدفق الخلايا ببطء في السائل (Sheath fluid)

ركز السائل الناقل على الخلايا في مركز الأنبوب ، وبالتالي تنتقل الخلايا إلى نقطة القياس بانتظام وفي مسار افتراضي. . وتسمى هذه الظاهرة ، التي تنتج معلومات فريدة من جسيم أو خلية في مقياس التدفق الخلوي ، تأثير (Hydrodynamic focusing) معدل تدفق العينة هو في التدفق الخلوي من 5 إلى 50 م / ث ، والقدرة على جمع البيانات من 5000 إلى 50000 خلية في الثانية ، وحجم عينة الدم المطلوبة عادة حوالي 100 ميكرولتر أو أقل. هذا يتميز التدفق الخلوي كأسلوب ممتاز في الدراسات السريرية

النظام الضوء (البصريات)، يتكون هذا النظام عادة من واحد أو أكثر من مصادر الضوء (مصباح ليزر أو قوس) مع عدد من العدسات ، والمرشحات ، وأجهزة الكشف. تستخدم العدسات والمرشحات لمركبة ونقل مصدر الضوء إلى نقطة القياس، وكذلك لتجميع وتوجيه إشارات الضوء المتفرقة ومستقبلات ضوئية المنبعثة من نقطة القياس إلى أجهزة الكشف. إن إنتاج الضوء بطول موجي صغير جدًا في مصادر ضوء الليزر مهم جدًا لمصابيح الإضاءة الأخرى نظرًا لأنه كلما زاد تركيز الضوء ومحدودًا في مساحة أصغر ، فإن مقدار الإثارة للجسيم أو مادة الفلورة المتصلة بالجسيم أو ستكون الخلية أكثر. أيضا ، فإن التركيز على شعاع ضوء سيضمن أن الضوء هو مجرد جسيم أو خلية في وقت واحد. من بين الأنواع المختلفة من الليزر ، يتم استخدام ليزر الأرجون بطول موجة يبلغ 488 نانومتر.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام ليزر ديود 635 نانومتر أيضا في أجهزة قياس التدفق الخلوي. واحدة من أهم القضايا في أجهزة التدفق الخلوي هي التحديد المتزامن لنوع وترتيب المرشحات الضوئية وموقع العديد من الإشارات الضوئية. في شكل مرشحات Long pass ، يمكن أن تمر الأسلاك خلال أطوال موجية أعلى من المستوى المطلوب. بينما تسمح مرشحات تمرير قصيرة Short pass موجية أقل.

تقوم مرشحات band pass فقط بعمل موجات ذات أطوال موجية خاصة وتمريرها عبر نطاق ضيق. كل هذه الفلاتر تمنع مرور الضوء من خلال الهندسة الميكانيكية التي تمتص الضوء.

يشمل قطاع الإلكترونيات محولات الإشارة الضوئية على إشارات الإلكترونيات التي يمكن معالجتها بواسطة الحاسوب. عندما يتم تحويل الإشارات الضوئية إلى إلكترونية ، على أساس قالب موحد يسمى مقياس التدفق الخلوي (FCS) يتم تخزين البيانات من الإشارات الإلكترونية ، ويمكن استخدام هذه البرامج لجمع المعلومات ومعالجتها ، ورسم بياني أحادي أو ثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد للمعلومات أو لإجراء حسابات حسابية وإحصائية على المعلومات.

اعداد تعليق خلية العينة

من أجل السماح لقياس التدفق الخلوي عالي الحساسية للكشف عن ضوء الليزر المشتت أو الفلورة المنبعثة من خلية بين أنواع الخلايا ، يجب تعليق الخلايا بشكل موحد في وسط سائل. تختلف طرق تحضير التعليق للعينة وفقًا لنوع الخلية التي يتم تقييمها. بعد إعداد التعليق المناسب ، يتم تصنيف الخلايا مباشرة بالفلوریات أو الأجسام المضادة المرتبطة بالفلوریه. يؤثر مستوى خصوصية الجسم المضاد ، ومستوى المستضد في السطح أو في الخلية ، ومدى ملاءمة تركيز الجسم المضاد المستخدم ، وتطبيق الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة في تحليل الخلايا ، على طريقة وضع العلامات.

كل خلية ، من حيث نوعها وخبرتها ، تعبر عن جزيئاتها الخاصة. وتعبر معظم المجموعات الفرعية للخلايا الموجودة في الدم البشري عن علاماتها السطحية الخاصة التي يمكن أن تساعدها في التعرف عليها. جزيئات الخلايا السطحية هي تحت الاسم العام Cluster Differentiation (CD) ، وتستخدم الأجسام المضادة المترافقة وحيدة النسيلة مع الفلوركروم للكشف عنها. على سبيل المثال ، تحتوي الخلايا التائية على جزيئات CD3 على سطحها ويمكن لجزيئات CD4 و CD8 اكتشاف مجموعتين متميزتين من هذه الخلايا. CD19 موجود فقط في الخلايا B و CD56 و CD16 موجودة في الخلايا القاتلة الطبيعية (NK).

يعتمد الحجم الأدنى المطلوب للعينة على كمية الخلايا في خلايا العينة ، وإذا كانت النسبة المئوية للخلايا المدروسة منخفضة مقارنة بالخلايا الأخرى ، فيجب إزالة جزء من الخلايا غير المرغوب فيها أولاً. يجب أن يكون قطر الخلايا المقيمة في نطاق من 1 إلى 30 ميكرون ، ولا ينبغي أن تكون أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية حساسة لتقييم الجسيمات الأصغر من 1 ميكرون.

اليوم ، في مقياس التدفق الخلوي ، يتم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة لدراسة الخلايا وفحص هيكلها ومحتواها. في هذه الطريقة ، يمكن الكشف حتى عن جسيمات أصغر من 0.1 ميكرومتر، وعتبة اللونية الخاصة بها هي حوالي 1000 جزيء من اللون ، أو 10-118 × 1 غرام من اللون لكل خلية.

يتضمن تصميم الاختبار وإجرائه بشكل صحيح اختيار الأجسام المضادة المناسبة واختيار الفلوركروم بالتناسب مع تركيز وموضع المستضد، والتطبيق السليم لتحضير عينة الخلايا، والتعديل الدقيق للجهاز يتطلب الخبرة والمعلومات التي يجب أن يكون لدى الشخص الذي يقوم بإجراء الاختبار. الخطوات الصحيحة والدقيقة لمنع الأخطاء في عملية جمع المعلومات ومرحلة تحليل المعلومات ستكون مفيدة.

عرض النتائج

إن اختيار الخلايا المرغوبة وإزالة النتائج المرتبطة بالخلايا غير المرغوب فيها مثل خلايا الميت وديبرمان هو أحد أهم مبادئ قياس التدفق الخلوي المعروف باسم Gating ، حيث يوفر كل نظام قياس التدفق الخلوي برنامجًا خاصًا لاستقبال البيانات وعرضها وتحليلها على جهاز الحاسوب. جهازك الخاص به. سيعرض هذا البرنامج النتائج النهائية لتحليل البيانات كرسم بياني. هناك أنواع مختلفة من الرسوم البيانية في التدفق الخلوي ، وكلها تمثل تمثيلًا كميًا لمؤشر ما.

رسم النقطة (Dot Plot)

في هذا النوع من الرسم البياني، تمثل كل نقطة جسيمًا، وكل تجمع تراكمي للجسيمات في كثافة صغيرة أو منخفضة. ويستند موقف هذه الجسيمات على الرسم البياني على شدة وضعف الإشارة الناتجة عنهم والإشارة التي يستقبلها الكاشف.

مخطط ( Density Plot )

في هذا المخطط، تظهر كثافة النقاط التي تمثل تجمعات الخلايا بألوان مختلفة

مخطط (Contour Plot)

ويمثل تراكم النقاط (الخلايا) في الخطوط ويشبه خرائط الجغرافيا.

رسوم بيانية (histogram)

على النقيض من المخططات السابقة التي تقوم في الوقت نفسه بتحليل معلمتين، في هذا المخطط، يتم عرض قياس المعلمة (التألق النسبي لشدة الانتثار الضوئي) على المحور X وعدد الجسيمات (الخلايا) ان تکون على المحور Y.

العتبة (Threshold)

تحديد الحد الأدنى لمقدار الإشارة، للتسجيل بواسطة المكشاف، يسمى العتبة. وهذا يعني أنه يتم عرض الإشارات التي تساوي أو تزيد عن القيمة المحددة من قبل المستخدم ، أي الإشارات المسجلة فقط في المكشاف الذي تتجاوز قيمته العتبة.

تعويض التعرض (Compensation)

الفلوریات عبارة عن مزيلات تقوم بامتصاص وإثارة الطاقة الضوئية عند أطوال موجية معينة وتصدر الإشعاع عند طول موجة أكبر وأعلى. طيف من الألوان مضان واسع جدا. في دراسات مضان متعدد الألوان ، قد تتداخل أطياف بعض الفلوروكرومات. في هذه الدراسات ، ينبغي اختيار اختيار الفلوروکرومات بعناية لاختيار الأقل التداخل بين الفلوریات. ومع ذلك ، فقد لوحظ في كثير من الحالات أن الفلوروکرومات المختارة متداخلة.

في مثل هذه الحالات ، للتغلب على النتائج الصحيحة ، يجب التخلص من هذا التداخل. يشير مصطلح Compensation إلى تصحيح تدفق اللون في تحليل بيانات التدفق الكمي. يستخدم هذا المصطلح ، يسمى ارتباط مضان ، في تحليل البيانات ، لحساب النسبة المئوية لتداخل الفلوركروم في قناة لم يتم تعيينها له. هذا يؤدي إلى نتائج موثوقة عند التداخل بين الفلوروکرومات.

تطبيقات قياس التدفق الخلوي

كشف النمط الوراثي وتحديد الخلايا بدقة وتحديدها (مستقبلات سطح الخلية أو المكونات الخلوية)
قياس النشاط الأنزيمي
دراسة النشاط موت الخلايا المبرمج (موت الخلية)
تحديد محتوى الحمض النووي للخلية
تجارب اختراق الكالسيوم
التصنيف وفصل الخلايا

الاختبارات المتاحة

ملاحظة:

يتم استخدام عينات مختلفة بما في ذلك شفط نخاع العظم والدم المحيطي ومختلف السوائل بما في ذلك CSF ، السائل الجنبي ، وما إلى ذلك لاختبار التدفق الخلوي.
أفضل مضادات التخثر لعينات الدم المحيطي ونخاع العظم هي EDTA
حجم المطلوبة لاختبار التدفق الخلوي من 2 مل من الدم الكامل ، كما هو الحال مع عينة CBC
يجب إجراء الاختبار في أقل من 24 ساعة ومن الأفضل إرساله إلى المختبر مباشرة بعد أخذ العينات.
أمثلة غير مقبولة لمدة 24 ساعة بعد أخذ العينات.
لا تجمد العينة لأن التجميد يؤدي إلى تحلل الخلايا ويجعل التقييم مستحيلاً.
يجب نقل العينة إلى المختبر عند درجة حرارة الغرفة (24-20 درجة مئوية) ، ولكن إذا كان الهواء دافئًا وتم نقل المسافة من المختبر إلى المختبر في حالة الثلاجة.

الموارد المختارة:

Flow Cytometry Protocols second Edition Edited by Teresa S.Hawley, Robert G.Hawley
Flow Cytometry Principles and Applications Edited by Marion G. Macey, PhD
Practical Flow Cytometry Fourth Edition HOWARD M. SHAPIRO

الاعزاء السکنی فی الاهواز، يمكنهم استخدام مختبر باستور في الأهواز بأفضل التسهيلات والتقنيات اليوم لأي نوع من التجارب.

مع افضل الشکر و الاحترام إدارة موقع مختبر أهواز – باستور