امراض البکتریایه

البکتریایه

قسم الكشف الجزيئي

تستخدم إحدى طرق تكرار الحمض النووي DNA طريقة PCR. بسبب الاستخدامات و الفوائد العديدة ، توسعت هذه الطريقة بسرعة في المختبرات الجزيئية وهذه الطريقة تستخدم الآن بشكل شائع في هذه المختبرات.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

في عام 1983 ، عملت کاری موليس على تفاعل سلسلة البلمرة لتضخيم تسلسل الحمض النووي DNA معين. من حيث المبادئ العملية ، يشتمل PCR على تشابه كبير لتكاثر الحمض النووي DNA ، وهو ماخوذ منه بالفعل.

تتكون تقنية PCR من دورات متكررة يتم فيها تسخين الحمض النووي DNA وتبريده باستخدام الاشعال ، ويتم تخزين إنزيم بوليميريز الحمض النووي المقاوم للحرارة بشكل ملائم وأيون + Mg² ، وبوجود أربعة dNTPs (DNA) ، يتم بناء نموذج الحمض النووي على القالب الحمض النووي يؤدي النسخ المتماثل. عملية نسخ الحمض النووي DNA هي الأسية في هذه الطريقة ، وبالتالي يمكن الحصول على كمية كبيرة من الحمض النووي DNA. الاشعال تكمل أجزاء من سلسلتين من الحمض النووي DNA وتحدد المنطقة المطلوب ضربها.

اليوم ، طريقة PCR لها دور هام جدا في تحديد وعزل الجينات والاستنساخ والبيولوجيا الجزيئية ،

علم الأحياء الدقيقة التشخيصي ، تشخيص السرطان والأمراض الوراثية ، تحديد الهوية ، علم الإجرام ، التسلسل ، علم الآثار ، دراسة تطورية للكائنات الحية.

خطوات PCR

خطوة التهيئة: (Initialization step) هذه الخطوة ضرورية فقط للحمض النووي DNA بوليميريز الذي يتطلب تنشيط الحرارة في طريقة PCR start hot. في هذه المرحلة ، تكون درجة حرارة التفاعل في محلول التفاعل من 94 إلى 96 درجة مئوية لفترة معينة.
خطوة تغيير المجرى: (Denaturation step) في هذه المرحلة ، بسبب انهيار روابط الهيدروجين بين النيوكليوتيدات ، يتم فصل نوعين من أنماط الحمض النووي DNA ويتم الحصول على خيوط واحدة من الحمض النووي DNA هذه المرحلة هي الجزء الأول من الدورات الحرارية وتتضمن تسخين محلول التفاعل لفترة محددة من 94 إلى 96 درجة.
خطوة التلدين: (Annealing step) في هذه المرحلة ، يتم تخفيض درجة حرارة التفاعل إلى 50 إلى 65 درجة مئوية ، ويتم تصميم الاشعال التي تشبه جانبي جزء DNA المراد إعادة إنتاجه لتكمل تسلسلها التكميلي في شقين متصلين DNA ياتون. توفر هاتان القطعتان المفتوحتان ΄۳ نشاط البلمرة DNA.
خطوة الامتداد / الاستطالة: (Extension/elongation step) يتم استخدام درجة حرارة المذيب في هذه الخطوة ، اعتمادا على نوع DNA البلمرة. تتراوح درجة الحرارة المثلى لإنزيم بوليميريز Taq ما بين 75 و 80 درجة ، والتي يتم اختيارها عادة عند درجة حرارة 72 درجة. في هذه المرحلة ، فإن إنزيم بوليميريز الحمض النووي DNA ، باستخدام أربعة منشئي الحمض النووي DNA للمصدر المفتوح في المحلول ، يشكل تسلسل الحمض النووي DNA الجديد بترتيب من 5 إلى 3 ومقابل خيوط القالب. يجب أن يتناسب طول هذه الخطوة ایضا مع نوع بوليميريز الحمض النووي DNA وطول حبلا الحمض النووي. في هذه المرحلة ، في ظل وجود الركيزة الكافية وتوفير الظروف المثلى ، يتضاعف محتوى الحمض النووي في محلول PCR. لذلك ، في كل دورة من دورات PCR ، يزيد تركيز الحمض النووي DNA بشكل كبير.
الاستطالة النهائية: (Final elongation) يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد دورة PCR نهائية عند درجة حرارة تتراوح من 70 إلى 74 درجة ، لضمان أن يتم تكرار جميع فروع الحمض النووي DNA.
تعليق نهائي:( (Final hold) في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الحل النهائي من 4 إلى 15 درجة لفترة قصيرة.

دورة درجة الحرارة وتضخيم الجينات المستهدفة في اختبار PCR

رحلان كهربائي في جل اغارز: اخیرا ، يمكن أن تحلل منتجات PCR على هلام اغارز مع علامة وزن جزيئي (سلم DNA يحتوي ladder على شظايا DNA محددة) ، ويتم فحص نتائج PCR.

خطوات لأداء الكهربائي

رد فعل RT-PCR

RNA يشكل الحمض النووي الريبي (mRNA) و (rRNA) بأعداد كبيرة في الخلايا حقيقية النواة للحيوانات والنباتات والفطريات وكذلک في البكتيريا. في تقنية RT-PCR ، لأنه يتم استخدام RNA كقالب نسخ متماثل ، يجب تحويل مرحلة RNA إلى cDNA. يتم تحويل RNA الحمض النووي الريبي المستخرج إلى کدنا باستخدام إنزيم يسمى cDNA ناقلات النسخ العكسي. ثم يتم نسخ cDNA التي تنتجها تقنية PCR.

Real time PCR

طريقة PCR هي تقنية ذات حساسية عالية وخصوصية للكشف عن الأحماض النووية ، والتي تم تأسيسها واستخدامها بشكل جيد ، ولكن ليس من السهل تحديد الأحماض النووية المحددة الموجودة في العينة والتغيرات التي قد تحدث أثناء التحضير والتخزين ، أو إجراء رد فعل ، من الصعب تحديد كمية الأحماض النووية المحددة بدقة. السرعة التي يتم بها إجراء التجربة ، والقضاء على المرحلة اللاحقة لفترات طويلة مثل الرحلان الكهربي للهلام أو Southern blotting، ومراقبة لحظة رد الفعل وحتى لحظة رد الفعل وإنهائها في أي وقت ، والحساسية العالية والخصوصية ، وإجراء تفاعل كمي ، والحصول على الكمية الدقيقة من الجينوم في الطريقة الحقيقية لقد أحدثت Real time PCR تحولا كبيرا في مجالات العلوم المختلفة.

تم تقديم الفكرة الأولى لهذا النهج من قبل هيغاشي وزملاوه ، وهو مفهوم الملاحظة الفورية لحظية استنادا إلى مقدار التألق المنبعث من التفاعل والملاحظة والتسجيل في المعرف. في هذه الطريقة ، يتم استخدام مسبار ذو تسمية خصص التوصيلية للجينوم المستهدف. تستخدم هذه الطرق حاليا في مجموعات التشخيص بطريقتين. في الطريقة الأولى، يضاف المسبار إلى المنتج بعد النسخ المتماثل ويضاف إلى المنتج أثناء عملية التهجين. هذه الطريقة، التي لها حساسية عالية، تشكل أساس Micro array المصفوفة الدقيقة وتستخدم لتحديد التركيب الوراثي. في الطريقة الثانية ، يكون المسبار موجودا في التفاعل ويتحلل أثناء الانتشار ويصدر ضوءًا يمكن قياسه في ای دورة معينة. هذه هي طريقة Real time PCR في الوقت الحقيقي.

طرق العلامات الشائعة في Real time PCR

طرق الوسم المستخدمة في Real time PCR يمكن تقسيمها إلى فئتين.

استخدام الألوان المرتبطة بالحمض النووي DNA

Syber green I هو اللون الأكثر استخدامًا في أنظمة الكشف غير المحددة nonspecific في دراسات البيولوجيا detection system، ولكن تم استخدام ألوان أخرى أخرى مثل Amplifour موخرا. Cybergren هو لون فلوري قابل للذوبان ولا يرتبط بقليل من التألق ، ولكن مع ربط DNA الجزيئي الصغير (DNA Minor Groove) بربط الصلب وتسلسل الحمض النووي ، ينبعث منه ضوءا مضيا في وقت واحد مع زيادة مضاعفة الحمض النووي DNA . أساس طريقة القياس في الوقت الحقيقي هو أن كمية ضوء الفلورسنت المنبعثة في كل دورة يقرأها الجهاز.

يحصل على يمثل مقدار ضوء الفلورسنت المنبعث مستوى النموذج الأولي ويتناسب بشكل مباشر مع كمية منتجات PCR. عندما يتم مضاعفة الحمض النووي DNA في دورات متتالية ، يقترن اللون بالمنتجات التي يتم نشرها ويزداد شدة الإسفار عند 520 نانومتر. تزداد إشارة الإسفار في طور التمديد extension ، بمعنى آخر ، أقصى مضان في نهاية مرحلة الامتداد وعلى الأقل في مرحلة التغيیر extension . مضان المنبعث من الجهاز denaturation هو التعرف وقابلة للقياس.

أساس طريقة سایبرجرین

هذه الطريقة سهلة للغاية وفعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب تصميم المسبار والمشاكل المرتبطة به. بطبيعة الحال ، نظرا لأن سایبرجرین لا يقتصر على تسلسل معين ولا يمكن تمييزه بين الحمض النووي DNA الناتج والمنتج غير المحدود والاشعال التمهيدي ، يجب رسم منحنى Melting Curve Analysis وفقا لمخطط الانصهار لكل رسم بياني . وبالتالي ، بعد نهاية PCR ، يزيد الجهاز درجة حرارة منتجات PCR إلى 94 درجة. عند درجة الحرارة هذه ، تكون جميع الحمض النووي DNA تقطعت بهم السبل ، ثم تنخفض درجة الحرارة بانتظام ، مع تحريف الحمض النووي DNA واستبدال وربط السيبرني والزيادة المفاجئة لكمية الإنبعاث المنبعث هو منحنى انصهار يمكن تمييزه بواسطة غير محددة ، او حتی محددة ، والتمهيدي التمهيدي عن طريق تحليل منحنى الانصهار. يتم إذابة منتجات PCR ذات متواليات أو أطوال متفاوتة في درجات حرارة مختلفة وتوفر ذروة محددة. في استجابة لذلک ، فقط منتج PCR خاص ، ساعي واحد فقط مرئي.

بمعنى آخر، في هذه الطريقة، يزيد الجهاز ببطء من درجة حرارة العينات ويزيد بشكل مستمر من شدة كل مضان من درجة حرارة أقل من نقطة الانصهار إلى درجة حرارة أعلى من نقطة انصهار المنتج (التي يحددها المستخدم في نطاق). يتم إذابة المنتجات وفقا لطول وكمية GC في الشريط عند درجات حرارة مختلفة. يتميز ذوبان كل منتج بانخفاض مفاجئ في كثافة مضان العينة التي يقيسها الجهاز. من خلال فحص الفرق في منحنيات الانصهار ، يتم تحديد نقطة الانصهار لكل منتج مضروب. بهذه الطريقة ، يمكن الحصول على الكمية الفعلية للمنتج في نهاية التفاعل.

تحليل الرسم البياني درجة حرارة الانصهار

2 – باستخدام مسبار

مع هذه التحقيقات ، زادت الحساسية والنوعية. في هذه التحقيقات ، لون مضان يسمى مراسل Reporter في 5 ولون مضان آخر في 3 يسمى Quencher. عندما يكون Reporter و Quencher على مقربة (في الوضع المعتاد للمسبار) إذا كان الضوء ينبعث من Quencher ولم يتم تسجيله ، ولكن بمجرد فصل هذين اللونين (بسبب انتشار وانهيار المسبار) ، لا يتم امتصاص الضوء المنبعث من مراسل Reporter بواسطة Quencher ويمكن قياسه من قبل الجهاز كما مضان.

الألوان المستخدمة فی Real time PCR

مسبار Taq Man: إنزيم Taq Polymerase يحط من نشاط ΄ ۵ النواة أثناء انتشار نمط المسبار ، ثم Reporter من Quencher يتم عزل المراسل من المخمد وينبعث التألق.

مسبار Taq Man

مسبار Beacon:

يحتوي هذا المسبار على بنية على شكل حلقة بألوان في نهايتي 3 و 5 ، لكنه لا ينقسم إلى Taqman ويستخدم في الدورات اللاحقة.

مسبار Beacon

3- Hybridization Probes

في هذا النظام، المسمى Fret (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ، تم تصميم المسبار في شكلين مختلفين، وألوان مضان التألق هي واحدة في نهاية 3 والآخر في نهاية 5 ، ثم عندما يتم تطبيق هذين اللونين بعد إرفاق التحقيق. بالإضافة إلى ذلک، يتم إصدار مضان وقياس بواسطة الجهاز.

طرق في Real Time PCR

يتم قياس منتج التسلسل المستهدف بطريقتين:

الكمي المطلق ( Absolute Quantification)

في هذه الطريقة، يتم حساب عدد التتابعات المستهدفة في العينة عادة باستخدام إشارة Real Time PCR نسبة إلى المنحنى القياسي. يمكن رسم المنحنى القياسي وفقا للمعايير المحددة. يتم استخدام هذه الطريقة دون حساب المنحنى القياسي وحساب عدد النسخ في التشخيص النوعي في مجموعات التشخيص.

الكمي النسبي (Relative Quantification)

في المقياس النسبي ، يتم التعبير عن التعبير الجيني المرغوب به من حيث الجينات الهيكلية الخلوية المعروفة باسم House Keeping Gene. واحدة من الجينات الهيكلية للخلية هي Act-Actin و GAPDH. هذه الطريقة أكثر قابلية للتطبيق في تقييم التعبير الجيني ، إلى جانب Absolute Quantification القياس الكمي المطلق.

مع العديد من التطورات التي تحققت اليوم، يتم استخدام هذه التقنية كوسيلة دقيقة وحساسة لتحديد الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. في هذه التقنية ، يتم قياس منتجات PCR خلال المرحلة الأسية لعملية PCR.

يمكن اكتشاف إشارة التألق خلال أو بعد كل دورة من دورات PCR ويتم الحصول على نتائجها على مدى فترة زمنية قصيرة. أيضا ، نظرا لعدم فتح باب أنابيب التفاعل ، يكون خطر تلوث منتجات PCR منخفضا للغاية. يحدد القياس الكلي Exponential phase)) للمنتجات في Real Time PCR القدرة على التفاعل ، مما يجعل اختيار تقييمات أكثر حساسية ممكنا. يوجد حاليا العديد من الأدوات المتاحة Real Time PCR التي تقيس مجموع المنتجات باستخدام مضان في كل دورة. مضان قياس يتناسب مع دورة تمثل التضخيم. Amplificationفی الواقع، فان افضل مرحله استنساخ یتم فیها الحصول علی بیانات مفیده و متکرره هی مرحله ثابته. فی هذه المرحله من دوره الانتشار، هناک علاقه وثیقه بین کمیه الحمض اللنووی DNAالأساسي والمنتج المنتشر. Real Time PCR هو الحل الأمثل لتحديد كمية المنتج في هذه المرحلة. تشمل أجهزة PCR في الوقت الحقيقي اليوم أجهزة التنظيف الحراري ومقاييس الفلور التي تقيس كمية التألق في كل دورة. يجمع الكمبيوتر المتصل بالجهاز البيانات ويعرضها في شكل رسوم بيانية. يتم تسجيل بيانات صورة الإسفار مرة واحدة على الأقل لكل دورة استنساخ. يمكن للمستخدم التحكم في معدل التكاثر لكل عينة في كل دورة ومراقبة مقدار التكرار مقارنة بالمعايير والتحكم الإيجابي والتحكم السلبي.

الرسم البياني الازدواجية لوغاريتمي في Real Time PCR

بالإضافة إلى ذلک، يمكن للمستخدم التحكم في جميع الاستجابات أثناء عملية التكاثر ويمكنه ، استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها خلال الدورات ، تحسين إرشادات الماكينة ، مما يزيد من الحساسية والخصوصية والكفاءة. بعد جمع البيانات الأولية ، تبدأ مرحلة التحليل. سيقوم البرنامج بتطبيع جهاز البيانات بناء على اختلافها مع مضان المجال. عند الانتهاء من التطبيع، يمكن تحديد خط العتبة. الخط هو العتبة الخطية التي سيتم تحليل البيانات عليها. عدد الدورات حتى يصل منحنى العينة إلى خط العتبة ، CT. يتم اختيار خط العتبة بحيث يتم تعظيم مقدار تكرار الحمض النووي DNA في المرحلة الثابتة لإعطاء نتائج أكثر دقة وقابلة للتكرار.

الرسم البياني الازدواجية الخطية Real Time PCR

تسمى الدورة التي ينحني Real time PCR رسم Threshold في الوقت الحقيقي بخط العتبة CT ، ومن هذه الدورة ، يدخل التكاثر في المرحلة اللوغاريتمية ، ويصل إلى المراحل الأسية Exponential ويصل في النهاية إلى مرحلة تشبع الهضبة Plateau.