الكروماتوغرافيا سائل عالي الكفائه

(High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC ))

كروماتوغرافيا hplc هي وسيلة لاكتشاف وفصل وقياس المواد. يعد HPLC (تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الضغط أو كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء) أحد أكثر طرق الكروماتوغرافيا المستخدمة على نطاق واسع.

يتكون HPLC من مرحلتين ثابتتين ومتنقلتين. هذه هي المرحلة الصلبة أو السائلة (المرحلة الصلبة في العمود) والمرحلة المتنقلة السائلة. تفصل هذه الطريقة المكونات المكونة للخليط على الطور الثابت باستخدام الطور المتحرك. يتم إذابة المركبات اولا في مذيب ، ثم يتم دفقها تحت عمود الضغط العالي في عمود اللوني ، وبالتالي يتم فصل المركبات في العمود. تعتمد درجة الدقة على مقدار التفاعل بين المركبات المذابة والمرحلة الثابتة. يمكن أن یودی تحديد المذيبات المختلفة والمراحل الثابتة إلى تغيير تفاعل الكائن المذاب مع المرحلتين المتحركة والثابتة. حساسيتها العالية ، قابليتها للتكيف السريع للقياسات الكمية ، وتطبيقها على نطاق واسع في مختلف مجالات العلوم والصناعة ، جعلت HPLC واحدة من أكثر الطرق كفاءة للنمو السريع بين طرق الفصل التحليلي.

HPLC هي عملية امتصاص ديناميكية. عندما تتحرک جزيئات مادة الاختبار عبر الحبوب الكثيفة المسامية للعمود ، يتم امتصاصها. في أساليب HPLC ، قد تكون الأنواع المختلفة من قوى الامتزاز فعالة في عملية التثبيط. التفاعلات الأكثر أهمية في فصل الطور العكسي ، بين التفاعلات الكارهة للماء ، في طريقة الطور العادية ، التفاعلات القطبية ، والتفاعلات الأيونية تمنع المركبات في كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. كل هذه التفاعلات تعمل بشكل تنافسي مع بعضها البعض. تتنافس الجزيئات المتحللة مع الجزيئات القابلة للذوبان في المذيبات لتتكثف في المواقع النشطة في المرحلة الثابتة. لذلک ، فإن الجزيئات الأكثر تحللا لها تفاعل أقوى مع السطح ، وأضعف تفاعل المنظفات ، وكلما طالت المادة المتحللة على سطح الطور الثابت.

تشمل تطبيقات HPLC الأحماض الأمينية والبروتينات والأحماض النووية الكربوهيدراتية والعقاقير والمبيدات الحشرية والمضادات الحيوية والمنشطات ومجموعة متنوعة من المواد العضوية وغير العضوية.

ميزات HPLC

طريقة HPLC سهلة الاستخدام للغاية.

وقت التحليل قصير جدا.

في نظام HPLC ، تعمل مرحلتان ثابتتان ومتنقلتان بآلية تنافسية تتيح إجراء تحليل دقيق.

في هذه الطريقة ، لكل مجموعة من المركبات المحددة ، هناک كاشفات انتقائية خاصة تزيد من كمية ونوعية التحليل.

يتم تحليل المركبات العضوية المتطايرة وغير المتطايرة بسهولة.

يتم عزل وتطهير وتوصيف البروتينات والمركبات العضوية ، وخاصة المكونات الصيدلانية ، بشكل جيد مع هذه الطريقة.

التحليل الكمي مع حساسية عالية ودقة ممكن.

تحديد هيكل البوليمرات

مقارنة بين هياكل البروتين المختلفة

أي شوائب ذات أقطاب مختلفة يمكن اكتشافها.

وجود شوائب عالية الوزن الجزيئي يمكن اكتشافه.

وجود الماء في عينات الاختبار لم يسبب أي مشاكل أثناء التحليل.

يمكن تقييم جزيئات الماء ذات الروابط الهيدروجينية.

إعادة الإنتاج هي واحدة من المزايا الرئيسية لنظام HPLC.

أجزاء مهمة من آلة HPLC

نظام نقل المذيبات (مضخة)
محقن (Injector)
عمود
الكاشف
الحاسوب لتقييم المعلومات

نظام نقل المذيبات (مضخة)

3 في آلة HPLC ، تكون الأعمدة طويلة نسبيا وحجم الجسيمات منخفض وبالتالي يتم تقليل النفاذية. لكي يتدفق المحلول ، يجب أن يكون هناک ضغط ناتج عن المضخات. تأخذ المضخة الحل من الخزان وتحركه بسرعة ثابتة بسرعة محددة. كلما انخفض تدفق الطور المتحرک ، زادت مسافة القمم.

المذيبات في HPLC

تشتمل المذيبات المستخدمة في HPLC على مخازن الماء المقطر بالميثانول – الأسيتونيتريل.

يجب أن تكون طريقة HPLC هي الماء المقطر مرتين في الماء المقطر وترشيحها قبل استخدامها مع فلتر مياه 45.0 ميكرون.

يجب أن تكون المذيبات ذات نوعية جيدة (نقاء). بالتأكيد ، يجب تصفية هذه المذيبات بفلتر عضوي 45.0 ميكرون قبل الاستخدام.

في HPLC ، يجب أن تكون مذيباتنا خالية من الغازات مثل الأكسجين ؛ يستخدم غاز الهيليوم عالي النقاء.

محقن (Injector)

تستخدم الإبر ذات القيم المختلفة للحقن. حجم الحقن 30 ميكروليتر. تقوم العينة اولا بإدخال قسم يسمى جاردکالوم أو بری کالوم ، وهو واقي عمود ومملوء بمواد من مواد تعبئة العمود. إذا كانت مادة الاختبار بها شوائب أو تتفاعل مع المادة الموجودة داخل العمود، يتم إجراوها في قسطرة القلب ولا تتلف العمود.

عمود

يعتمد اختيار العمود على المواد التي تم اختبارها ، وتمتلئ الأعمدة بمواد مختلفة. يتم تضمين المرحلة ثابتة في عمود من الجسيمات الدقيقة. يتم ذلک عن طريق فصل وتشتيت مكونات العينة ومرور المرحلة المتنقلة. العينة اولا يدخل جاردکالوم ثم يدخل العمود. يعتمد عمل العمود على حجم الجزيئات في العمود. أصغر حجم الجسيمات ، وأفضل جودة HPLC. على سبيل المثال ، يتم تعبئة العمود C18 بهلام السيليكا المعدل.

وغالبا ما تستخدم أجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.